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 Nano-bio-systèmes |
Microscopie appliquée aux matériaux du vivant  |
Responsables:
- Nicolas PAPAGEORGIOU (Délégation CNRS)
Sommaire
| Objectifs |
L’imagerie des systèmes du vivant (cellule, virus, protéine, complexes protéiques et ADN(ARN)/protéine) est en pleine évolution grâce à de nouveaux développements technologiques. Les différents stratégies utilisées, se trouvent à l’interface de la biologie, la physique, la chimie, l’instrumentation, l’informatique ou encore les mathématiques. A l'IMN nous avons entrepris un travail interdisciplinaire entre la physique et la biologie en collaboration avec ’équipe de Virologie Structurale du laboratoire d’Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques, AFMB, http://www.afmb.univ-mrs.fr. Techniques
- Microscopie électronique en transmission (MET) avec coloration négative sur Hitachi HNAR9000, 300keV et Hitachi HF2000, 200keV.
- Microscopie à Force Atomique, AFM et Microscopie à effet tunnel, STM (Veeco Nanotech)
Sujet
Étude des protéines et de leur complexes impliquées dans la réplication du génome du corona virus du Syndrome Respiratoire Aigu Sévère (SARS-CoV) avec comme but la localisation, et la mesure des interactions moléculaires entre les protéines impliquées dans la réplication du génome et leur substrat (brins de ARN).
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| Protéines à l'etude |
 Fig1 A droite: La structure 3D de la protéine nsp9 mesurée par diffraction X (code PDB: 1QZ8). A gauche: La cellule unité du cristal 3D de nsp9.
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Nsp9 et Nsp10 du SRAS-CoV (Nsp = Non Structural Protein). Ces deux protéines sont impliquées dans le mécanisme de réplication elles présentent une affinité pour les brins de ARN, mais leur fonction exacte est inconnue. Nous étudions leur complexification avec des brin de ARN, synthétique (acid polycytidylic poly C et polyurilidylic poly U) et/ou ARN viral sub-génomique du virus du SRAS. |
Fig2: A Gauche et A droite : Film epais de proteines nsp9 comportant des structures filamenteuses et agrégats. Images MET; 300kV en coloration négative (2% Acétate d'uranyle). Au centre : Les structures filamenteuses sont des filaments de nsp9 comme celui ci fait d'une succession des cellules unitaires.
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Les coronavirus (http://www.microbiologybytes.com/virology/Coronaviruses.html) [1] (sont des virus à ARN simple brin positif, leur génome est le plus grand connu (~ 30 000 nucléotides) avec paradoxalement un taux d’erreur de réplication très faible, et enfin ils codent pour de nombreuses protéines impliquées dans la réplication. Au niveau de la compréhension des mécanismes de réplication de ces virus, tout reste à découvrir. L’activité biochimique de polymérases de coronavirus n’a été décrite que dans une seule publication et aucune donnée sur les structures tridimensionnelles de ceshttp://www.microbiologybytes.com/virology/Coronaviruses.html polymérases n’existe. Jusqu’à l’émergence du virus responsable du SARS-CoV, les coronavirus étaient des virus peu étudiés du fait de leur faible pathogénicité vis-à-vis de l’homme.
[1] Michael M. C. Lai & Kathryn V. Holmes. Coronaviridae: The Viruses and Their Replication. Field's Virology
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Le SARS-CoV est responsable d’une pneumopathie atypique1AFX.pdb associé à un taux de mortalité d’environ 10%. L’explication la plus plausible concernant l’émergence du SARS-CoV est le franchissement de la barrière d’espèce animal/homme puisqu’il a été récemment montré que la chauve-souris en est le réservoir naturel. Depuis le SARS-CoV, 4 nouveaux coronavirus pathogènes chez l’homme ont été identifiés, responsables de bronchiolites ou du syndrome de Kawasaki.
Le mécanisme de réplication de ces virus exceptionnels de part la taille de leur génome d’ARN reste mal connu. Néanmoins, les données existantes montrent une grande diversité structurale et un mécanisme réplicatif unique. Par exemple, ces virus codent leurs propres exo- et endonuclease, dont les rôles restent inconnus. Une caractérisation approfondie des protéines de ces complexes réplicatifs, de leurs interactions ainsi que du mécanisme précis de réplication de ces virus pourrait non seulement permettre de développer des molécules anti-coronavirus, mais devrait également servir de guide pour l’exploration de la réplication d’autres virus négligés. |
Fig 4: Brins de ARN polyC recouverts de nsp9, MET x30000, defocus 600nm, coloration négative Ammonium Molybdate 2% (barre = 100 nm). |
Figure 5: La structure 3D de la protéine nsp10 mesurée par diffraction X (code PDB: 2G9T)
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Figure 6: nsp10 en coloration négative, x30000, defocus -300 nm,
(Ammonium molybdate 2%).
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